實驗室廢宅腐女

    上一章講到跑電泳，那我就繼續講westen blot的其他步驟啦！跑完電泳後，蛋白質已經依據分子量大小分離完成，但是蛋白質sample都是無色的，所以看不到、也無法分析，因此需要加上抗體去辨認蛋白質，並且加入呈色劑讓蛋白質上的抗體發出螢光，這樣才能分析。可是跑電泳的膠體太過脆弱、而且也不方便上抗體，因此使用Transfer轉印的方法，先讓蛋白質跑到能吸附蛋白質的PVDF膜或是NC paper上面，這樣才好操作。

Transfer

    跑Transfer跟跑膠很像，都是跑電泳。但是SDS-PAGE的目的是為了讓不同分子量的蛋白質在電場中不等速的跑，Transfer是為了讓所有蛋白質都等速的跑到PVDF膜上。Transfer的卡夾中，要裝的東西有很多，由上而下的排列大致為：

1. 菜瓜布

2. 濾紙片

3. PVDF膜

4. 膠

5. 濾紙片

6. 菜瓜布

    通常是打開卡夾後由下往上一層一層鋪，鋪好後把卡夾裝進Transfer的槽中，確認卡夾鋪的順序沒有鋪反、插卡槽沒有差反、接上電線沒有接反，調好電壓就可以開始跑了。依照各個實驗的流程安排，有人選擇這一步開低電壓overnight，隔天來收，也有人選擇開高電壓跑兩個小時，做到下一步或下下一步才overnight。

Blocking

          Transfer完的膠應該是全透明的，看不到原本上面有的marker顏色，而且PVDF膜上應該要有marker的顏色，這樣蛋白質才算成功跑上去。如果膠和膜上都沒有東西的話，很可惜，大概是因為哪個步驟裝反邊，所以蛋白質sample跑到別邊了，恭喜實驗重來！Transfer好後的膠丟掉，PVDF membrane要做後續的處理。為了讓膜上透明的蛋白質顯色，要先加入可以辨識要分析的那個蛋白質的抗體，稱為一級抗體，簡稱一抗。接著要加入可以辨識這個一抗的另外一個抗體，這個抗體不僅可以辨識一抗，尾端還帶有螢光酵素，經過活化之後就可以產生螢光，這個抗體被稱作二級抗體，簡稱二抗。但是不管是一抗還是二抗，他們都是蛋白質，而PVDF膜也可以吸附蛋白質，所以如果直接加入抗體在沒有處理的PVDF膜上的話，整片膜上都會是訊號，無法分辨要分析的目標蛋白。因此先使用牛奶來做Blocking，也就是使用牛奶這個蛋白質來封閉PVDF膜上沒有蛋白的空白區域。通常牛奶是使用奶粉配在PBST溶液裡面，依據實驗需求，比例也會不同，我只使用過5%的牛奶。

上抗體

    Blocking完就可以接著上抗體，首先先加入一抗，大學部使用一抗的時候，通常是學姊已經配好並凍在冰箱冷凍櫃裡面了，只要做實驗錢拿出來退冰使用即可。唯一要注意的就是，一抗使用完是要回收再使用的，而且membrane的每個區域都要上到抗體。二抗通常需要自己配，我使用的濃度是1:20000，所以需要先配好5%牛奶，再從冰箱拿二抗的分裝管自己配，用完倒水槽。整體上抗體的流程，就是上一抗、回收一抗、wash三遍、上二抗、倒掉二抗、wash三遍。其中wash步驟是為了將沒接上目標的抗體洗去，以免產生多餘的訊號。

ECL呈色 + 壓底片

    接下來要將membrane放進cassette中，cassette是用來把membrane帶去暗房壓底片的。首先會在cassette打開後，鋪一層透明的塑膠片，叫做投影片的樣子。接著先放著不管，先把membrane澆上ECL試劑一分鐘，活化二抗上的螢光酵素，一分鐘到後小心將membrane吸乾，鋪在cassette的投影片上面，接著再鋪一層投影片，接著黏好這三張東西，確定不會移動，就可以把cassette關上，帶著cassette、底片、timer、剪刀、手套去暗房壓底片。

    暗房關上門後一片漆黑，有一盞不怎麼亮的紅外燈，是唯一的光源，要不然連自己的手都看不到。確認沒有任何除了紅外燈以外的光源（像手機、運動手環、發光手錶）就可以打開底片盒，拿出底片，裁剪出自己需要的大小、打開cassette、快狠準的把底片押在membrane上，再把cassette關上，開始計時。時間到了，快狠準的打開cassette、取出底片，放入洗片機中洗。在暗房很難看到洗片機的電源在哪，通常他的設計只有一個按鈕、就是總開關，所以直接使用盲人摸象法（？）碰到開關按下去，機器就會啟動。等到底片沖洗完，就可以看成品的樣子，如果底片燒掉了，那就是押的時間太久了，應該要減少壓的秒數；如果底片不清楚，那就是壓的時間太短了，應該要增加壓的秒數；但是最多人遇到的問題，應該是底片沖洗出來模糊不清，那是因為底片放下去cassette或是從casstte中取出的過程動到了底片，所以呈像才會模糊有重影。基本上講究個熟能生巧，而且底片要剪個角做記號，因為底片沖洗出來的訊號是蛋白質sample的訊號，沒有marker的訊號，如果要知道蛋白質sample的分子量，就要回去的時候把底片對在casste的membrane上，才能知道蛋白質sample位在哪個分子量。如果匹片沒有剪角的話，會把正反左右上下邊，每一個邊都搞混了。

    以上，就是粗略的western blot步驟介紹，其實每間實驗室買的廠牌不同，也有不同功效，我介紹的也僅僅是我們實驗室使用的方法，另外也有使用commassie blue直接將澆體染色的方法，因為我年資尚淺，所以從未操作過。很多大學部學生剛進實驗室就是先學western blot，並不是他很簡單，而是他很重要。我寫的其實只是大略的步驟，沒講到很多小細節，每一個小細節都有可能影響到實驗結果。我做了七八次，次次都無法像學長姊一樣完美，甚至對著自己寫的實驗步驟都還有做失敗的經驗。大家憶起加油吧！(心累