實驗室廢宅腐女

    Western blot 是給蛋白質定性定量的一個方法，定性的意思是確認代測物是何種蛋白，定量就是確認該蛋白的量有多少。

大致的流程應該是：跑膠(SDS-PAGE)、Transfer、Blocking、上一抗、上二抗、暗房壓底片，是進實驗室最初會學的基本技術。

這篇文章大概就是初步的講一下Western的流程和原理，給那些大學部學生剛進實驗室學技術，苦查半天資料卻看不懂的人看的。

跑膠（SDS-PAGE）

    跑膠包括做膠、和跑電泳。SDS-PAGE其實是一種跑電泳的技術，是依據不同分子量的蛋白質在電場中游動的速度不同，而用來區分不同分子量的蛋白質的技術。在操作上，首先會做膠，會有一張配方表告訴你要加入的藥品和材料的量，加好後等膠凝固就可以拿去跑膠，而膠的材料也各自有各自的功能：

1. SDS: 是一種帶大量負電荷的界面活性劑，可以把形狀不一的蛋白質攤開成線型，均一的裝上負電荷，使分子量大的蛋白質帶比較多的負電、使分子量小的蛋白質帶比較少的負電。
2. Acrylamide: 是膠體形成孔洞的主要材料，依據acrylamide的濃度不同，可以分離不同分子量的蛋白質。
3. APS: 讓膠體凝固的主要材料，通常做膠的時候會最慢才加APS，否則太早加下去會太早凝固。
4. Temed: 催化劑，讓APS凝快一點的東西，有股味道。
5. Tris buffer: 調整膠體的pH值，分成pH6.8和8.5的兩種，上膠的Tris使用6.8的，下膠使用8.5的。

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    做膠的時候，膠體又分成上膠和下膠。上膠的英文是stacking gel，顧名思義是要將蛋白質堆疊擠壓的意思。下膠的英文是separating gel，翻譯過來就是要將蛋白質分開。做膠時，會先配好下膠、倒入做膠台一半以上的某個定點（每個實驗室不太一樣），接著馬上倒入酒精補滿整個膠台，因為酒精和膠體不互溶，所以可以將還是液態的膠體壓平。等下膠凝固至少也要十分鐘或是更久，通常會趁這個時候配待會要用的上膠。

    通常配完的下膠倒入膠台後還會有剩，可以觀察剩下的下膠有沒有凝，就可以大概知道膠台裡面的下膠凝固了沒。除了使用沒用完的下膠來判斷膠體凝固了沒，還可以看看膠台裡面有沒有「一條清楚的分界線」來判斷下膠凝固了沒。前面有說過，下膠的膠體和酒精是不互溶的，所以當下膠凝結後，可以看到酒精跟膠體之間的分界線。當下膠凝固好了之後，就可以把酒精倒出來，再倒入上膠，上膠把膠台倒滿之後，馬上！插入！齒梳！並且把氣泡趕走或是用乾淨的tip尖戳破。

    做好的膠的長相大概就是上面這張圖，虛線以上都是上膠，需線以下都是下膠，當然實際上是沒有這條虛線的，這只是張是意圖。上膠頂端凹下去的部分就是well，是插入齒梳後形成的凹槽，也是跑膠的時候注入我們想定量的蛋白質sample的地方。做好的膠會在做膠的玻璃裡面，將玻璃從膠台上拆下來、拔掉齒梳清洗、再放入電泳槽裡面，並把電泳槽裡面倒滿running buffer，接下來就要準備想分析的蛋白質sample。

    想要分析的蛋白質sample要加入sample buffer後，95度C熱5分鐘，為的是打斷蛋白質的雙硫鍵，讓兩塊靠雙硫鍵黏合的蛋白質分開，加入sample buffer後的蛋白質sample可以被帶入倒well的底端。還記得上一段有講到，將電泳槽倒滿running buffer嗎？當well裡面充滿runnng buffer，單純的、小體積的、分子量小的蛋白質sample很容易飄出well，但是與sample buffer混和後的sample，會跟著分子量大、密度也大的sample buffer一起被帶進well的底部，這樣sample就不會損失了！

    與sample buffer混勻、也95度C加熱過的sample，就可以注入well裡面，有加sample的左右兩邊的空well要加入marker和sample buffer。marker是有很多不同已知分子量的蛋白質混和物，而且肉眼可見。一般來說，跑膠的時候是不知道蛋白質sample跑到哪的，因為sample沒有顏色，是透明的，那判斷有沒有好好分離蛋白質的依據就只剩下marker了！只要我知道我想分析的蛋白質分子量是多少，就能對照那附近的marker來推測蛋白質在什麼位置。

    加好sample和marker之後，注意正負電的黑色紅色兩種電線不要接反，設定完電壓就可以開始跑電泳了，通常會跑很久（我的常常最快也要跑兩個小時），所以可以趁機去吃飯補眠~

    在跑電泳的過程中，sample首先會從well中跑進上膠，上膠（stacking gel）的Tris buffer的pH是6.8，蛋白質在這個區域跑的速度非常的慢，因此原本在well裡面均勻分布的蛋白質會被濃縮成一條細細的線，蛋白質在這個區域堆疊濃縮的目的，是為了使縮有的蛋白質sample，不管當初是分布在well頂端或是well底部的sample，都能在同一個時間進入到下膠（separating gel）中分離，使所有sample都有同一個起跑線。當sample進入到下膠的時候，下膠pH值是8.5，蛋白質在這個區域跑得很快，而且帶越少負電的蛋白跑的越快，那什麼但白帶越少負電呢？還記得我們做膠的時候加了SDS嗎？SDS將蛋白質攤開，並均勻的帶上負電，因此分子量越小的蛋白質但越少負電，分子量越大的蛋白質帶越多負電。造成的結果就是：分子量越小的蛋白質會跑到膠體的越下面，分子量越大的蛋白質會跑到膠體的越上面，這樣就可以依據分子量的區別純化蛋白質。